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五色熒光標記20個基因座復合擴增體系及法醫學應用

發布時間 : 2015-10-20 15:42:00

五色熒光標記20個基因座復合擴增體系及法醫學應用姜先華1，賈菲1，趙金玲1，沈紅纓1，陳初光2，金萍2，郭飛3，李秋陽1，邵武1，于蛟1(1．遼寧省刑事科學技術研究所，遼寧沈陽110032;2.基點認知技術(北京)有限公司，北京100190;3.中國醫科大學法醫學院，遼寧沈陽110002)【摘要】目的建立20個基因座五色熒光標記復合擴增檢測體系，并評價其法醫學應用價值。方法收集368份無關人血樣及55份實際案例樣本(包括血斑、體液斑、組織及毛發)，采用五色熒光素標記技術，對Amelogenin和19個STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、PentaE、TH01、D12S391、D2S1338和FGA)進行基因型檢測，并考察方法的一致性、靈敏度、種屬特異性及檢材適用性。結果本文五色熒光標記復合擴增檢測體系可對所選20個基因座分型，結果穩定準確，且均衡性良好、無雜峰;群體調查顯示累積個人識別率和累積非父排除率分別是0.999999999999999999999和0.99999999;靈敏度達125pg，種屬特異性高，實際案例檢材分型成功率高。結論本文五色熒光標記復合擴增檢測體系各項指標可達到當前商品化試劑盒的檢測水平，具有重要的法醫學應用價值?！娟P鍵詞】法醫物證學;五色熒光標記;復合PCR;20個基因座;法醫DNA分型【中圖分類號】DF795.2【文獻標識碼】A【文章編號】1001－5728(2012)03－0185－05Developmentofa20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRforforensicpurposes(JiangXianhua1，JiaFei1，ZhaoJinling1，ShenHongying1，ChenChuguang2，JinPing2，GuoFei3，LiQiuyang1，ShaoWu1，YuJiao1/1.LiaoningCriminalScienceandTechnologyInstitute，Shenyang110032，China;2.PeoplespotInc．，Beijing100190，China;3.ChinaMedicalUniversitySchoolofForensicMedicine，Shenyang110002，China)【Abstract】ObjectiveToconstructa20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRforforensicpurposes．Methods368unrelatedindividualbloodsamplesand55routinecasesamples(includingbloodstains，bodyfluidstains，tissues，andhairs)werecollected．Amelogeninand19STRloci(D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，PentaD，vWA，D8S1179，TPOX，PentaE，TH01，D12S391，D2S1338andFGA)wereusedtoconstructa20-plexPCRsystemusingafivecolorfluorescencelabelingtechnique，andthentheconsistency，sensitivity，species-specificityandbiologicalsamplesapplicabilitywereevaluated．ResultsThe20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRsystemwasofwellaccuracy，stabilityandbalance，whichshowedrichgeneticinformation(thecumulativediscriminationpowerandcumulativechanceofexclusionreachedto0.999999999999999999999and0.99999999respectively)，highsensitivity(125pg)，highspecies-specificityandhighgenotypingsuccessrateforroutinebiologicalsamples．ConclusionTheperformanceofthis20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRsystemcanwinthatofthecurrentcommercialkits，andithasimportantapplicationvalueinforensicscience．【Keywords】forensicbiologicalevidence;fivecoloredfluorescently-labeled;PCRmultiplex;20loci;forensicDNAtyping多色熒光STR復合擴增技術具有高效、靈敏、穩定等優點，在法醫DNA分析廣泛采用［1］。目前常用的16個基因座檢測方法中，AmpFISTRIdentifilerTM、SinofilerTM(美國AB公司)為五色熒光標記，PowerPlex16(美國Promega公司)和GoldeneyeTM16A、16BT、16C(中國基點認知公司)均為四色熒光標記［2］。五色熒光比四色熒光標記技術容納更多的基因座，可增加一次檢驗基因座的數量，提高數據庫應·185·中國法醫學雜志CHINJFORENSICMED2012年第27卷第3期用效率和個人識別能力，并可與目前普遍使用的毛細管電泳檢測儀器相適應。本文采用五色熒光復合擴增技術對20個基因座進行檢測，并考察該體系各項技術指標，為法庭科學DNA分析提供一種新方法。1材料與方法1.1樣品用于方法考察及群體遺傳學分析的無關個體血痕樣本368份;用于法醫學應用研究的已知個體來源的案件檢材55份，包括10份血斑、10份精液/女性陰道液混合斑、10份汗液斑、10份唾液斑、5份肋軟骨、5份肌肉組織和5份毛發;均為本實驗室2000－2010年采集或檢案積累。用于特異性檢驗的豬、雞、魚樣品購于本市農貿市場。1.2復合擴增體系的建立1.2.1基因座的選擇為獲得更多信息量，提高非父排除率和個人識別力，本文依照《我國法庭科學DNA數據庫選用的基因座》(GA469－2004)標準，并兼容當前DNA身份鑒定常用試劑盒的全部STR基因座的原則，選定了20個基因座，相關信息見表1。表120個基因座的相關信息Table1Relatedinformationof20STRLoci基因座染色體定位等位基因范圍PCR產物長度/bp熒光標記物D19S43319q12～13.19～17.291～127FAMD5S8185q21～317～15142～175FAMD21S1121q21.124～38198～256FAMD18S5118q21.38～27283～357FAMD6S10436q16.19～21.3376～428FAMD3S13583p2112～20123～156HEXD13S31713q22～317～15171～204HEXD7S8207q11.21～226～14212～245HEXD16S53916q22～245～15260～301HEXCSF1PO5q33.3～346～15319～354HEXPentaD21q22.32.2～17369～441HEXAmelXp22.1～22.3，YX/Y106/112TMRvWA12p12～pter10～22124～172TMRD8S11798q24.1～24.27～18203～248TMRTPOX2p23～2pter7～13274～299TMRPentaE15q26.25～26322～423TMRTH0111p15～15.54～13.394～134ROXD12S39112p13.214～27145～197ROXD2S13382q35～37.115～28215～268ROXFGA4q2816～46.2278～402ROX1.2.2引物的設計和合成引物設計原則為:20～30bp之間，各基因座引物Tm值盡量一致;PCR產物片段長度在450bp以內。引物經HPLC檢測分析，純度大于99%。依據熒光素光譜特性、檢測靈敏度等對常用的熒光標記物進行比較，選出彼此干擾最小的5種熒光素組合標記引物(表1)。1.2.3復合擴增體系的建立和優化建立20個基因座的復合擴增體系，并進行調整、優化實驗［3-6］:引物濃度設置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。引物退火溫度設置梯度(56、57、58、59、60、61、62℃)。緩沖液濃度設置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。模板濃度以9947A標準品DNA(10ng/μL)為模板，設置梯度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5ng)。PCR循環次數在以上確定的最佳引物濃度、退火溫度、緩沖液濃度、DNA濃度條件下，設置PCR循環次數梯度(27、28、29、30、31、32)。1.2.4PCR產物的檢測采用ABI3130XL型遺傳分析儀及GeneMapper3.2軟件對PCR產物進行檢測和分型。編制與復合擴增體系中的基因座相對應Panel和與等位基因數據項對應Bin，導入GeneMapper3.2軟件用于分析判型。1.3擴增體系指標驗證及法醫學應用1.3.1擴增體系技術指標驗證一致性368份無關個體血樣采用TECAN工作站磁珠法提取DNA，STR分型結果與SinofilerTM和PowerPlex16分型結果進行一致性和成功率比較。靈敏度采用美國Promega公司的9947ADNA(10ng/μL)進行靈敏度檢測。模板定量為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng進行檢測，平行重復3次。種屬特異性設置人源性和非人源性檢材(豬、雞、魚)，測試方法的種屬特異性。1.3.2案件檢材應用血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織和毛發樣本，經Chelex100法提取DNA，采用本文方法檢測，與SinofilerTM和PowerPlex16分型結果比對。2結果與討論2.1檢測方法及遺傳學調查本文最終選擇的五色熒光復合擴增總體系·186·中國法醫學雜志CHINJFORENSICMED2012年第27卷第3期10μL，內含:模板DNA0.5ng、2.5×PCR緩沖液4μL、5×引物混合物2μL、GoldTaq1U0.2μL。PCR循環參數為:95℃5min;94℃30s、60℃1min、70℃1min，共30次循環;最后60℃延伸30min。電泳檢測:取1μLPCR產物、8.5μL去離子甲酰胺、0.5μLORANGE500分子量內標，混勻，95℃變性3min，立即冰浴;使用ABI3130XL型遺傳分析儀電泳分離，毛細管36cm，“DyeSet”選擇“E5”。采用GeneMapperIDv3.2軟件進行分析。結果表明，本方法可對所選20個基因座成功分型，且均衡性良好，峰型對稱尖銳、無雙肩峰等雜峰。應用本文方法對368份無關個體血痕樣本進行檢測，19個STR基因座數據采用直接計數法和PowerStatsV12軟件(http://www．promega．com)進行遺傳學統計分析。結果表明:各基因座基因型觀察值和期望值之間無顯著差異，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。19個STR基因座的等位基因及其頻率以及相關遺傳學參數見表2、3。表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五色熒光標記20個基因座復合擴增體系及法醫學應用姜先華1，賈菲1，趙金玲1，沈紅纓1，陳初光2，金萍2，郭飛3，李秋陽1，邵武1，于蛟1(1．遼寧省刑事科學技術研究所，遼寧沈陽110032;2.基點認知技術(北京)有限公司，北京100190;3.中國醫科大學法醫學院，遼寧沈陽110002)【摘要】目的建立20個基因座五色熒光標記復合擴增檢測體系，并評價其法醫學應用價值。方法收集368份無關人血樣及55份實際案例樣本(包括血斑、體液斑、組織及毛發)，采用五色熒光素標記技術，對Amelogenin和19個STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、PentaE、TH01、D12S391、D2S1338和FGA)進行基因型檢測，并考察方法的一致性、靈敏度、種屬特異性及檢材適用性。結果本文五色熒光標記復合擴增檢測體系可對所選20個基因座分型，結果穩定準確，且均衡性良好、無雜峰;群體調查顯示累積個人識別率和累積非父排除率分別是0.999999999999999999999和0.99999999;靈敏度達125pg，種屬特異性高，實際案例檢材分型成功率高。結論本文五色熒光標記復合擴增檢測體系各項指標可達到當前商品化試劑盒的檢測水平，具有重要的法醫學應用價值?！娟P鍵詞】法醫物證學;五色熒光標記;復合PCR;20個基因座;法醫DNA分型【中圖分類號】DF795.2【文獻標識碼】A【文章編號】1001－5728(2012)03－0185－05Developmentofa20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRforforensicpurposes(JiangXianhua1，JiaFei1，ZhaoJinling1，ShenHongying1，ChenChuguang2，JinPing2，GuoFei3，LiQiuyang1，ShaoWu1，YuJiao1/1.LiaoningCriminalScienceandTechnologyInstitute，Shenyang110032，China;2.PeoplespotInc．，Beijing100190，China;3.ChinaMedicalUniversitySchoolofForensicMedicine，Shenyang110002，China)【Abstract】ObjectiveToconstructa20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRforforensicpurposes．Methods368unrelatedindividualbloodsamplesand55routinecasesamples(includingbloodstains，bodyfluidstains，tissues，andhairs)werecollected．Amelogeninand19STRloci(D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，PentaD，vWA，D8S1179，TPOX，PentaE，TH01，D12S391，D2S1338andFGA)wereusedtoconstructa20-plexPCRsystemusingafivecolorfluorescencelabelingtechnique，andthentheconsistency，sensitivity，species-specificityandbiologicalsamplesapplicabilitywereevaluated．ResultsThe20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRsystemwasofwellaccuracy，stabilityandbalance，whichshowedrichgeneticinformation(thecumulativediscriminationpowerandcumulativechanceofexclusionreachedto0.999999999999999999999and0.99999999respectively)，highsensitivity(125pg)，highspecies-specificityandhighgenotypingsuccessrateforroutinebiologicalsamples．ConclusionTheperformanceofthis20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRsystemcanwinthatofthecurrentcommercialkits，andithasimportantapplicationvalueinforensicscience．【Keywords】forensicbiologicalevidence;fivecoloredfluorescently-labeled;PCRmultiplex;20loci;forensicDNAtyping多色熒光STR復合擴增技術具有高效、靈敏、穩定等優點，在法醫DNA分析廣泛采用［1］。目前常用的16個基因座檢測方法中，AmpFISTRIdentifilerTM、SinofilerTM(美國AB公司)為五色熒光標記，PowerPlex16(美國Promega公司)和GoldeneyeTM16A、16BT、16C(中國基點認知公司)均為四色熒光標記［2］。五色熒光比四色熒光標記技術容納更多的基因座，可增加一次檢驗基因座的數量，提高數據庫應·185·中國法醫學雜志CHINJFORENSICMED2012年第27卷第3期用效率和個人識別能力，并可與目前普遍使用的毛細管電泳檢測儀器相適應。本文采用五色熒光復合擴增技術對20個基因座進行檢測，并考察該體系各項技術指標，為法庭科學DNA分析提供一種新方法。1材料與方法1.1樣品用于方法考察及群體遺傳學分析的無關個體血痕樣本368份;用于法醫學應用研究的已知個體來源的案件檢材55份，包括10份血斑、10份精液/女性陰道液混合斑、10份汗液斑、10份唾液斑、5份肋軟骨、5份肌肉組織和5份毛發;均為本實驗室2000－2010年采集或檢案積累。用于特異性檢驗的豬、雞、魚樣品購于本市農貿市場。1.2復合擴增體系的建立1.2.1基因座的選擇為獲得更多信息量，提高非父排除率和個人識別力，本文依照《我國法庭科學DNA數據庫選用的基因座》(GA469－2004)標準，并兼容當前DNA身份鑒定常用試劑盒的全部STR基因座的原則，選定了20個基因座，相關信息見表1。表120個基因座的相關信息Table1Relatedinformationof20STRLoci基因座染色體定位等位基因范圍PCR產物長度/bp熒光標記物D19S43319q12～13.19～17.291～127FAMD5S8185q21～317～15142～175FAMD21S1121q21.124～38198～256FAMD18S5118q21.38～27283～357FAMD6S10436q16.19～21.3376～428FAMD3S13583p2112～20123～156HEXD13S31713q22～317～15171～204HEXD7S8207q11.21～226～14212～245HEXD16S53916q22～245～15260～301HEXCSF1PO5q33.3～346～15319～354HEXPentaD21q22.32.2～17369～441HEXAmelXp22.1～22.3，YX/Y106/112TMRvWA12p12～pter10～22124～172TMRD8S11798q24.1～24.27～18203～248TMRTPOX2p23～2pter7～13274～299TMRPentaE15q26.25～26322～423TMRTH0111p15～15.54～13.394～134ROXD12S39112p13.214～27145～197ROXD2S13382q35～37.115～28215～268ROXFGA4q2816～46.2278～402ROX1.2.2引物的設計和合成引物設計原則為:20～30bp之間，各基因座引物Tm值盡量一致;PCR產物片段長度在450bp以內。引物經HPLC檢測分析，純度大于99%。依據熒光素光譜特性、檢測靈敏度等對常用的熒光標記物進行比較，選出彼此干擾最小的5種熒光素組合標記引物(表1)。1.2.3復合擴增體系的建立和優化建立20個基因座的復合擴增體系，并進行調整、優化實驗［3-6］:引物濃度設置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。引物退火溫度設置梯度(56、57、58、59、60、61、62℃)。緩沖液濃度設置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。模板濃度以9947A標準品DNA(10ng/μL)為模板，設置梯度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5ng)。PCR循環次數在以上確定的最佳引物濃度、退火溫度、緩沖液濃度、DNA濃度條件下，設置PCR循環次數梯度(27、28、29、30、31、32)。1.2.4PCR產物的檢測采用ABI3130XL型遺傳分析儀及GeneMapper3.2軟件對PCR產物進行檢測和分型。編制與復合擴增體系中的基因座相對應Panel和與等位基因數據項對應Bin，導入GeneMapper3.2軟件用于分析判型。1.3擴增體系指標驗證及法醫學應用1.3.1擴增體系技術指標驗證一致性368份無關個體血樣采用TECAN工作站磁珠法提取DNA，STR分型結果與SinofilerTM和PowerPlex16分型結果進行一致性和成功率比較。靈敏度采用美國Promega公司的9947ADNA(10ng/μL)進行靈敏度檢測。模板定量為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng進行檢測，平行重復3次。種屬特異性設置人源性和非人源性檢材(豬、雞、魚)，測試方法的種屬特異性。1.3.2案件檢材應用血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織和毛發樣本，經Chelex100法提取DNA，采用本文方法檢測，與SinofilerTM和PowerPlex16分型結果比對。2結果與討論2.1檢測方法及遺傳學調查本文最終選擇的五色熒光復合擴增總體系·186·中國法醫學雜志CHINJFORENSICMED2012年第27卷第3期10μL，內含:模板DNA0.5ng、2.5×PCR緩沖液4μL、5×引物混合物2μL、GoldTaq1U0.2μL。PCR循環參數為:95℃5min;94℃30s、60℃1min、70℃1min，共30次循環;最后60℃延伸30min。電泳檢測:取1μLPCR產物、8.5μL去離子甲酰胺、0.5μLORANGE500分子量內標，混勻，95℃變性3min，立即冰浴;使用ABI3130XL型遺傳分析儀電泳分離，毛細管36cm，“DyeSet”選擇“E5”。采用GeneMapperIDv3.2軟件進行分析。結果表明，本方法可對所選20個基因座成功分型，且均衡性良好，峰型對稱尖銳、無雙肩峰等雜峰。應用本文方法對368份無關個體血痕樣本進行檢測，19個STR基因座數據采用直接計數法和PowerStatsV12軟件(http://www．promega．com)進行遺傳學統計分析。結果表明:各基因座基因型觀察值和期望值之間無顯著差異，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。19個STR基因座的等位基因及其頻率以及相關遺傳學參數見表2、3。表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采用自主研發似然比率計算器進行ITO親緣關系分析