五色熒光標記 20 個基因座復合擴增體系及法醫學應用 姜先華1 ，賈 菲1 ，趙金玲1 ，沈紅纓1 ，陳初光2 ，金 萍2 ， 郭 飛3 ，李秋陽1 ，邵 武1 ，于 蛟1 ( 1． 遼寧省刑事科學技術研究所，遼寧 沈陽 110032; 2. 基點認知技術( 北京) 有限公司，北京 100190; 3. 中國醫科大學法醫學院，遼寧 沈陽 110002 ) 【摘要】目的 建立 20 個基因座五色熒光標記復合擴增檢測體系，并評價其法醫學應用價值。方法 收集 368 份 無關人血樣及 55 份實際案例樣本( 包括血斑、體液斑、組織及毛發) ，采用五色熒光素標記技術，對 Amelogenin 和 19 個 STR 基因座( D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA 、 D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338 和 FGA) 進行基因型檢測，并考察方法的一致性、靈敏度、種屬特異性 及檢材適用性。結果 本文五色熒光標記復合擴增檢測體系可對所選 20 個基因座分型，結果穩定準確，且均衡性良好、 無雜峰; 群體調查顯示累積個人識別率和累積非父排除率分別是 0. 999 999 999 999 999 999 999 和 0. 999 999 99; 靈敏度 達 125pg，種屬特異性高，實際案例檢材分型成功率高。結論 本文五色熒光標記復合擴增檢測體系各項指標可達到當 前商品化試劑盒的檢測水平，具有重要的法醫學應用價值。 【關鍵詞】法醫物證學; 五色熒光標記; 復合 PCR; 20 個基因座; 法醫 DNA 分型 【中圖分類號】DF795. 2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1001 － 5728( 2012) 03 － 0185 － 05 Development of a 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR for forensic purposes( Jiang Xianhua 1 ，Jia Fei 1 ，Zhao Jinling 1 ，Shen Hongying 1 ，Chen Chuguang 2 ，Jin Ping 2 ，Guo Fei 3 ，Li Qiuyang 1 ，Shao Wu1 ，Yu Jiao 1 /1. Liaoning Criminal Science and Technology Institute，Shenyang 110032，China; 2. Peoplespot Inc． ， Beijing 100190，China; 3. China Medical University School of Forensic Medicine，Shenyang 110002，China) 【Abstract】Objective To construct a 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR for forensic purposes． Methods 368 unrelated individual blood samples and 55 routine case samples ( including bloodstains，body fluid stains，tissues，and hairs) were collected． Amelogenin and 19 STR loci ( D19S433，D5S818，D21S11， D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，Penta D，vWA，D8S1179，TPOX， Penta E，TH01，D12S391，D2S1338 and FGA) were used to construct a 20-plex PCR system using a fivecolor fluorescence labeling technique，and then the consistency，sensitivity，species-specificity and biological samples applicability were evaluated． Results The 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR system was of well accuracy，stability and balance，which showed rich genetic information ( the cumulative discrimination power and cumulative chance of exclusion reached to 0. 999 999 999 999 999 999 999 and 0. 999 999 99 respectively) ，high sensitivity ( 125pg) ，high species-specificity and high genotyping success rate for routine biological samples． Conclusion The performance of this 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR system can win that of the current commercial kits，and it has important application value in forensic science． 【Key words】forensic biological evidence; fivecolored fluorescently-labeled; PCR multiplex; 20 loci; forensic DNA typing 多色熒光 STR 復合擴增技術具有高效、靈敏、穩 定等優點，在法醫 DNA 分析廣泛采用［1］。目前常用 的 16 個基因座檢測方法中，AmpFISTR Identifiler TM、 Sinofiler TM ( 美 國 AB 公 司 ) 為 五 色 熒 光 標 記， PowerPlex16 ( 美 國 Promega 公 司) 和 GoldeneyeTM 16A、16BT、16C( 中國基點認知公司) 均為四色熒光標 記［2］。五色熒光比四色熒光標記技術容納更多的基 因座，可增加一次檢驗基因座的數量，提高數據庫應 ·185· 中國法醫學雜志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 用效率和個人識別能力，并可與目前普遍使用的毛細 管電泳檢測儀器相適應。本文采用五色熒光復合擴 增技術對 20 個基因座進行檢測，并考察該體系各項 技術指標，為法庭科學 DNA 分析提供一種新方法。 1 材料與方法 1. 1 樣品 用于方法考察及群體遺傳學分析的無關個體血 痕樣本 368 份; 用于法醫學應用研究的已知個體來源 的案件檢材 55 份，包括 10 份血斑、10 份精液/女性陰 道液混合斑、10 份汗液斑、10 份唾液斑、5 份肋軟骨、 5 份肌肉組織和 5 份毛發; 均為本實驗室 2000 － 2010 年采集或檢案積累。用于特異性檢驗的豬、雞、魚樣 品購于本市農貿市場。 1. 2 復合擴增體系的建立 1. 2. 1 基因座的選擇 為獲得更多信息量，提高非父排除率和個人識別 力，本文依照《我國法庭科學 DNA 數據庫選用的基因 座》( GA469 － 2004) 標準，并兼容當前 DNA 身份鑒定 常用試劑盒的全部 STR 基因座的原則，選定了 20 個 基因座，相關信息見表 1。 表 1 20 個基因座的相關信息 Table 1 Related information of 20 STR Loci 基因座 染色體定位 等位基因 范圍 PCR 產物 長度/bp 熒光標 記物 D19S433 19q12 ～ 13. 1 9 ～ 17. 2 91 ～ 127 FAM D5S818 5q21 ～ 31 7 ～ 15 142 ～ 175 FAM D21S11 21q21. 1 24 ～ 38 198 ～ 256 FAM D18S51 18q21. 3 8 ～ 27 283 ～ 357 FAM D6S1043 6q16. 1 9 ～ 21. 3 376 ～ 428 FAM D3S1358 3p21 12 ～ 20 123 ～ 156 HEX D13S317 13q22 ～ 31 7 ～ 15 171 ～ 204 HEX D7S820 7q11. 21 ～ 22 6 ～ 14 212 ～ 245 HEX D16S539 16q22 ～ 24 5 ～ 15 260 ～ 301 HEX CSF1PO 5q33. 3 ～ 34 6 ～ 15 319 ～ 354 HEX Penta D 21q22. 3 2. 2 ～ 17 369 ～ 441 HEX Amel Xp22. 1 ～ 22. 3，Y X/Y 106 /112 TMR vWA 12p12 ～ pter 10 ～ 22 124 ～ 172 TMR D8S1179 8q24. 1 ～ 24. 2 7 ～ 18 203 ～ 248 TMR TPOX 2p23 ～ 2pter 7 ～ 13 274 ～ 299 TMR Penta E 15q26. 2 5 ～ 26 322 ～ 423 TMR TH01 11p15 ～ 15. 5 4 ～ 13. 3 94 ～ 134 ROX D12S391 12p13. 2 14 ～ 27 145 ～ 197 ROX D2S1338 2q35 ～ 37. 1 15 ～ 28 215 ～ 268 ROX FGA 4q28 16 ～ 46. 2 278 ～ 402 ROX 1. 2. 2 引物的設計和合成 引物設計原則為: 20 ～ 30bp 之間，各基因座引物 Tm 值盡量一致; PCR 產物片段長度在 450bp 以內。 引物經 HPLC 檢測分析，純度大于 99% 。依據熒光素 光譜特性、檢測靈敏度等對常用的熒光標記物進行比 較，選出彼此干擾最小的 5 種熒光素組合標記引物 ( 表 1) 。 1. 2. 3 復合擴增體系的建立和優化 建立 20 個基因座的復合擴增體系，并進行調整、 優化實驗［3-6］: 引物濃度 設置梯度( 0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、 0. 30、0. 35μmol /L) 。 引物退火溫度 設置梯度( 56、57、58、59、60、 61、62℃ ) 。 緩沖液濃度 設置梯度( 0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、 0. 30、0. 35μmol /L) 。 模板濃度 以 9947A 標準品 DNA( 10ng /μL) 為 模板，設置梯度( 0. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、1. 5、2. 0、 2. 5ng) 。 PCR 循環次數 在以上確定的最佳引物濃度、退 火溫度、緩沖液濃度、DNA 濃度條件下，設置 PCR 循 環次數梯度( 27、28、29、30、31、32) 。 1. 2. 4 PCR 產物的檢測 采 用 ABI 3130 XL 型 遺 傳 分 析 儀 及 GeneMapper3. 2 軟件對 PCR 產物進行檢測和分型。 編制與復合擴增體系中的基因座相對應 Panel 和與等 位基因數據項對應 Bin，導入 GeneMapper3. 2 軟件用 于分析判型。 1. 3 擴增體系指標驗證及法醫學應用 1. 3. 1 擴增體系技術指標驗證 一致性 368 份無關個體血樣采用 TECAN 工作 站磁珠 法 提 取 DNA，STR 分 型 結 果 與 Sinofiler TM 和 PowerPlex16分型結果進行一致性和成功率比較。 靈敏度 采用美國 Promega 公司的 9947ADNA ( 10ng /μL) 進行靈敏度檢測。模板定量為 2、1、0. 5、 0. 25、0. 125、0. 062 5ng 進行檢測，平行重復 3 次。 種屬特異性 設置人源性和非人源性檢材( 豬、 雞、魚) ，測試方法的種屬特異性。 1. 3. 2 案件檢材應用 血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織 和毛發樣本，經 Chelex100 法提取 DNA，采用本文方 法檢測，與 Sinofiler TM和 PowerPlex16分型結果比對。 2 結果與討論 2. 1 檢測方法及遺傳學調查 本文 最 終 選 擇 的 五 色 熒 光 復 合 擴 增 總 體 系 ·186· 中國法醫學雜志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 10μL，內含: 模板 DNA0. 5ng、2. 5 × PCR 緩沖液 4μL、 5 × 引物混合物 2μL、Gold Taq 1U0. 2μL。PCR 循環 參數為: 95℃ 5min; 94℃ 30s、60℃ 1min、70℃ 1min， 共 30 次循環; 最后 60℃ 延伸 30min。電泳檢測: 取 1μL PCR 產 物、8. 5μL 去 離 子 甲 酰 胺、0. 5μL ORANGE 500 分子量內標，混勻，95℃變性 3min，立即 冰浴; 使用 ABI 3130XL 型遺傳分析儀電泳分離，毛細 管 36cm，“DyeSet”選擇“E5”。采用 GeneMapper  ID v3. 2 軟件進行分析。結果表明，本方法可對所選 20 個基因座成功分型，且均衡性良好，峰型對稱尖銳、無 雙肩峰等雜峰。 應用本文方法對 368 份無關個體血痕樣本進行 檢測，19 個 STR 基因座數據采 用直接計數法和 PowerStats V12 軟件( http: / /www． promega． com) 進行 遺傳學統計分析。結果表明: 各基因座基因型觀察值 和期望值之間無顯著差異，均符合 Hardy-Weinberg 平 衡定律( P ＞ 0. 05) 。19 個 STR 基因座的等位基因及 其頻率以及相關遺傳學參數見表 2、3。 表 2 19 個 STR 基因座的等位基因頻率以及遺傳學參數( n = 368) Table 2 Allele frequencies and genetic parameters for 19 STR loci in Northern Han unrelated individuals D8S1179 D5S818 D7S820 D18S51 FGA D2S1338 D3S1358 D16S539 A F A F A F A F A F A F A F A F 10 0. 100 3 6 0. 001 4 7 0. 002 7 10 0. 001 4 15 0. 001 4 13 0. 001 4 12 0. 001 4 8 0. 013 7 11 0. 067 3 7 0. 016 5 8 0. 131 9 11 0. 005 5 18 0. 023 4 16 0. 005 5 14 0. 031 6 9 0. 289 8 12 0. 144 2 8 0. 001 4 9 0. 070 1 12 0. 038 5 18. 2 0. 001 4 17 0. 072 8 15 0. 340 7 10 0. 144 2 13 0. 221 2 9 0. 072 8 9. 1 0. 004 1 13 0. 212 9 19 0. 046 7 18 0. 111 3 16 0. 355 8 11 0. 222 5 14 0. 195 1 10 0. 217 0 10 0. 162 1 14 0. 222 5 20 0. 064 6 19 0. 129 1 17 0. 200 5 12 0. 211 5 15 0. 175 8 11 0. 339 3 10. 1 0. 001 4 15 0. 155 2 21 0. 076 9 20 0. 125 0 18 0. 063 2 13 0. 098 9 16 0. 074 2 12 0. 210 2 10. 3 0. 001 4 16 0. 112 6 21. 2 0. 001 4 21 0. 028 8 19 0. 006 9 14 0. 016 5 17 0. 017 9 13 0. 131 9 11 0. 317 3 17 0. 081 0 22 0. 169 0 22 0. 049 5 15 0. 002 7 18 0. 004 1 14 0. 006 9 12 0. 252 7 18 0. 041 2 22. 2 0. 009 6 23 0. 247 3 TH01 Penta E 15 0. 002 7 12. 1 0. 001 4 19 0. 033 0 23 0. 215 7 24 0. 156 6 A F A F CSF1PO 13 0. 053 6 20 0. 039 8 23. 2 0. 013 7 25 0. 060 4 6 0. 098 9 5 0. 039 8 A F D13S317 14 0. 001 4 21 0. 020 6 24 0. 207 4 26 0. 012 4 7 0. 241 8 7 0. 001 4 8 0. 002 7 A F D21S11 22 0. 024 7 24. 2 0. 005 5 8 0. 057 7 8 0. 001 4 9 0. 041 2 7 0. 002 7 A F 23 0. 006 9 25 0. 104 4 D6S1043 9 0. 533 0 9 0. 009 6 10 0. 237 6 8 0. 273 4 26 0. 001 4 24 0. 004 1 25. 2 0. 002 7 A F 9. 3 0. 045 3 10 0. 049 5 11 0. 251 4 9 0. 148 4 27 0. 001 4 26 0. 048 1 8 0. 001 4 10 0. 019 2 11 0. 122 3 12 0. 038 5 10 0. 145 6 28 0. 045 3 D12S391 27 0. 002 7 9 0. 001 4 10. 3 0. 001 4 12 0. 129 1 13 0. 063 2 11 0. 211 5 28. 2 0. 008 2 A F 28 0. 002 7 10 0. 037 1 13 0. 050 8 14 0. 015 1 12 0. 173 1 29 0. 241 8 14 0. 001 4 29 0. 002 7 11 0. 104 4 Penta D 14 0. 079 7 15 0. 002 7 13 0. 035 7 29. 2 0. 002 7 15 0. 013 7 12 0. 123 6 A F 15 0. 104 4 14 0. 009 6 30 0. 318 7 16 0. 005 5 D19S433 13 0. 159 3 6 0. 008 2 16 0. 086 5 vWA 30. 2 0. 012 4 17 0. 086 5 A F 14 0. 133 2 7 0. 005 5 17 0. 083 8 A F TPOX 30. 3 0. 005 5 18 0. 245 9 12 0. 050 8 15 0. 011 0 8 0. 033 0 18 0. 074 2 13 0. 002 7 A F 31 0. 108 5 19 0. 229 4 12. 2 0. 002 7 16 0. 002 7 9 0. 324 2 18. 3 0. 001 4 14 0. 247 3 7 0. 001 4 31. 2 0. 067 3 20 0. 175 8 13 0. 311 8 17 0. 038 5 10 0. 133 2 19 0. 056 3 15 0. 030 2 8 0. 512 4 32 0. 028 8 21 0. 098 9 13. 2 0. 038 5 17. 3 0. 001 4 11 0. 158 0 19. 1 0. 001 4 16 0. 190 9 9 0. 111 3 32. 2 0. 108 5 22 0. 075 5 14 0. 251 4 18 0. 162 1 12 0. 169 0 20 0. 046 7 17 0. 222 5 10 0. 030 2 33 0. 006 9 23 0. 042 6 14. 2 0. 118 1 19 0. 153 8 13 0. 136 0 21 0. 027 5 18 0. 200 5 11 0. 321 4 33. 1 0. 001 4 24 0. 015 1 15 0. 059 1 20 0. 059 1 14 0. 026 1 22 0. 017 9 19 0. 092 0 12 0. 020 6 33. 2 0. 031 6 25 0. 005 5 15. 2 0. 120 9 20. 3 0. 001 4 15 0. 005 5 23 0. 009 6 20 0. 013 7 13 0. 002 7 34 0. 002 7 26 0. 004 1 16 0. 015 1 21 0. 005 5 17 0. 001 4 24 0. 002 7 34. 1 0. 001 4 16. 2 0. 030 2 21. 3 0. 002 7 26 0. 002 7 34. 2 0. 005 5 17. 2 0. 001 4 22. 3 0. 001 4 27 0. 001 4 ·187· 中國法醫學雜志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 從表 2、3 可見，除 D3S1358、CSF1PO、TPOX、TH01 4 個基因座外均為高雜合度( H ＞ 0. 7) 、高識別能力( DP ＞0. 9) 和高信息量( PIC ＞ 0. 7) 基因座［7］。本方法累 積個人識別能力為0. 999 999 999 999 999 999 999，高 于 Identifiler TM 和 PowerPlex16［8-9］，累積非父排除率 為 0. 999 999 99，可為法庭科學 DNA 分析工作提供更 加準確的判斷依據，且可做到一次檢測獲得更多信 息，對數據庫建設和實際案件有重要意義。 表 3 19 個 STR 基因座遺傳學參數( n = 368) Table 3 Genetic parameters for 19 STR loci in Northern Han unrelated individuals 參數 D8S1179 D5S818 D7S820 D18S51 FGA D2S1338 D3S1358 D16S539 CSF1PO vWA He 0. 857 0. 783 0. 794 0. 841 0. 885 0. 893 0. 687 0. 816 0. 766 0. 813 DP 0. 953 0. 908 0. 920 0. 962 0. 961 0. 962 0. 869 0. 923 0. 874 0. 930 PIC 0. 820 0. 740 0. 750 0. 740 0. 840 0. 840 0. 660 0. 760 0. 680 0. 770 PE 0. 709 0. 568 0. 588 0. 677 0. 764 0. 781 0. 408 0. 629 0. 538 0. 624 參數 D13S317 TPOX D21S11 D12S391 D19S433 D6S1043 TH01 Penta D Penta E He 0. 799 0. 613 0. 841 0. 846 0. 830 0. 863 0. 647 0. 794 0. 931 DP 0. 932 0. 798 0. 936 0. 947 0. 933 0. 969 0. 814 0. 935 0. 985 PIC 0. 780 0. 560 0. 780 0. 810 0. 780 0. 860 0. 600 0. 780 0. 910 PE 0. 598 0. 306 0. 677 0. 687 0. 655 0. 720 0. 352 0. 588 0. 860 2. 2 方法指標驗證 一致性 368 份無關個體血樣經該方法檢測得 到的分型與 Sinofiler TM和 PowerPlex16 相同基因座的 分型結果完全一致，說明該檢測方法具有良好的準確 性和一致性。 靈敏度 經對不同模板量進行檢測，最佳模板量 為 0. 125 ～ 1. 0ng，峰高均值在 500 ～ 2 000Rfu 之間。 模板量低至 0. 062 5ng 仍可獲得完整 STR 分型結果， 但峰值小于 100Rfu，亦可出現雜合子峰高不均衡現 象。模板量為 2. 0ng 時，峰值達 6 000Rfu，易出現拔 起峰及雜峰，影響結果判讀( 圖 1) 圖 1 靈敏度檢測結果 Fig 1 The results of sensitivity study 種屬特異性 采用本文方法檢測豬、魚、雞的 DNA 樣品，結果與 Identifiler TM所報道的種屬特異性檢 測結果一致［10］。魚和雞樣品結果為陰性，豬樣品圖 譜分型區內均無擴增產物，僅在性別位點前出現 103bp 非特異性擴增峰，但不影響人源 DNA 判型( 圖 2) 。結果表明本文方法具有良好的種屬特異性。 圖 2 種屬特異性檢測結果 Fig 2 The results of species specificity study 2. 3 實際案例檢材應用 55 份案例檢材經 Chelex100 法提取 DNA，采用本 文方法進行分型檢測，與 Sinofiler TM 和 PowerPlex16 結果進行比對，各基因座均獲得一致的分型結果。當 檢材為低拷貝模板時，可獲得的基因座數量更多。例 如某案例的甲醛固定石蠟包埋樣本，采用本文方法和 ·188· 中國法醫學雜志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 Sinofiler TM使用相同模板量及電泳參數進行檢測，本文 方法得到 10 個基因座的分型，而 Sinofiler TM僅得到 7 個基因座的分型，且前者平均峰高高于后者( 圖 3) 。 圖 3 經兩種方法對甲醛固定石蠟包埋 檢材樣本的檢測結果 Fig 3 Electropherograms from the formaldehydefixed paraffin-embedded tissue specimen 綜上，本文建立的五色熒光標記復合擴增體系， 可對生物檢材 20 個基因座進行檢測，其個體識別能 力、非父排除能力、檢測靈敏度和檢材適用性等均可 達到當前商品化試劑盒的檢測水平，為法醫 DNA 分 析檢測提供了新方法，并因其可檢測到更多基因座， 故在提高數據庫比對中具有巨大應用潛力。 參 考 文 獻 ［1］Krenke B E，Tereba A，Anderson S J，et a1. Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system［J］． J Forensic Sci， 2002，47( 4) : 773. ［2］Song Y S，Patil A，Murphy E E，et al． Average probability that a “cold hit”in a DNA database search results in an erroneous attribution［J］． J Forensic Sci，2009，54( 1) : 22- 27. ［3］Grubwieser P， Muhlmann R， Parson W． New sensitive amplification primers for the STR locus D2S1338 for degraded casework DNA［J］． Int J legal Med，2003，117: 185-188. ［4］Danuta M S，Grzybowski T，Wozoniak M． Optimization of a hexaplex DNA amplification from short tandem repeat and amelogenin loci［J］． Electrophoresis，1997，18: 1627-1632. ［5］Klintschar M，Ebner A，Reichenpfader B． Population genetic studies on nine tetrameric short tandem repeat loci using fluorescence dyelabeled primers and capillary electrophoresis in the Austrian population［J］． Electrophoresis，1999，20: 1740-1742. ［6］Lazaruk K，Walsh P S，Oaks F，et al． Genotyping of forensic short tandem repeats ( STR) systems based on sizing precision in a capillary electrophoresis instrument ［J］． Electrophoresis，1998，19: 86-93. ［7］Gill P． A new method of STR interpretation using inferential logic development of a criminal intelligence database［J］． IN J Leg Med，1996，109: 14. ［8］李克研，喻少波，郝春雨，等． 遼寧省漢族人群 15 個短串 聯重復序列基因座的遺傳多態性［J］． 解剖學雜志，2010， 33( 2) : 248-251. ［9］周娟娟，洪素云． 中國漢族人群 15 個 STR 基因座遺傳多 態性研究及法醫學應用［J］． 中國免疫學雜志，2004，20 ( 12) : 841-842． ［10］Collins P J， Hennessy L K， Leibelt C S， et al． Developmental validation of a singletube amplification of the 13 CODIS STR loci，D2S1338，D19S433，and amelogenin: the AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit［J］． J Forensic Sci，2004，49( 6) : 1265-1277. ( 收稿日期: 2011-06-23) ( 上接第 184 頁) ［10］Rousset F． GENEPOP ' 007: a complete reimplementation of the GENEPOP software for Windows and Linux［J］． Molecular ecology notes，2008，8: 103-106. ［11］伍新堯，楊慶恩，劉雅誠，等． 親權鑒定判斷標準和結論 表述的建立［J］． 中山大學學報( 醫學科學版) ，2010，31